自己免疫疾患マーカー探索

新規自己免疫疾患バイオマーカー探索

SSc(全身性強皮症:Systemic sclerosis)は複雑で全身の臓器に病変が及ぶ膠原病の1種です。SScの診断には臨床的所見と自己抗体の検出が併用されていますが、従来の方法で使用されている自己抗体は60~70%の患者でしか検出されていませんでした。


Protagen社では同社独自のSeroTag™技術を活用し、複数のKDM6B(Lysine(K)-Specific Demethylase 6B)等の原を同定しました。


KDM6Bに対する自己抗体のキャラクタリゼーションを行うため、PEPperCHIP™マイクロアレイを利用したエピトープマッピングが実施されました。比較対象として、以前から同定されているCENPA(centromere protein A)特異的抗体に関するN末端PRRRSエピトープのマッピングも実施されました。


エピトープマッピングは15アミノ酸残基(1アミノ酸残基オフセット)のオーバーラッピングペプチドを用いて実施されました。健常人(HC)およびSScドナー3人(SSc1、SSc2およびSSc3)の血清を用いて実施した結果が下に示されています。患者血清ではCENPAおよびKDM6B由来エピトープのどちらに対しても強い反応を示し、良いSN比が得られました。


ペプチドアレイはSSc1、SSc2、SSc3およびHC血清と1:5,000の希釈率でアッセイされました。血清とインキュベーション後、2次抗体で染色され、測定が実施されました。HAおよびFLAGコントロールペプチドに対する抗体を用いた染色によって、アレイのフレームが明確化されています。


CENPA由来のエピトープを用いたエピトープマッピングではSPSPTPTPGPSRおよびGPSRRGPSLGASが全てのSSc 血清に対して反応することが観察されました。また、第3のエピトープTPTPGPSRRGPSの存在が示唆されました。


従来報告されていたN 末端PRRRSエピトープの他、少なくとも2種類の隣接するエピトープが同定されましたが、これは1アミノ酸残基オフセットによる高分解能エピトープマッピングによる効果と考えられました。


CENPAペプチドの強度プロットの結果。SSc1、SSc2およびSSc3の反応は強く、ほぼ一致したパターンを示しました。主たるエピトープとして2 種類(SPSPTPTPGPSRおよびGPSRRGPSLGAS)が同定され、明確ではありませんが第3のエピトープ候補(TPTPGPSRRGPS)も示されました。
3種類の血清中でSSc1のみが若干異なったピーク間の強度比を示し、他では観測されなかったN末端付近のエピトープ(RSPSPTPTPGPSR)が観測されました。


KDM6B由来のエピトープを用いたエピトープマッピングではLPAPLPPSHGSSが共通のエピトープとして同定されました。SSc1およびSSc2では2番目のエピトープSPQPSASSSSQFが同定されました。また、他にも単一のサンプルでのみ同定されたREKLNPPTPSIYLやSSQFSTSGGPWARといったエピトープが複数存在しました。

予想通り、健常人由来のHCではCENPAおよびKDM6Bのどちらに対しても反応が見られませんでした。

KDM6Bペプチドの強度プロットの結果。SSc1、SSc2およびSSc3の反応によるシグナル強度は中~強程度であり、部分的に一致したパターンを示しました。主たるエピトープとしては3種類共通のものが1種類(LPAPLPPSHGSS)が同定され、SSc1およびSSc2ではもう1種類(SPQPSASSSSQF)も示されました。
その他に、単一のサンプルでのみ反応を示したエピトープ、例えばREKLNPPTPSIYLやSSQFSTSGGPWARが存在しました。