エピトープのバリデーション

アミノ酸置換スキャンによるRituximabのコンフォメーションエピトープのバリデーション

抗体医薬Rituximabは抗CD20モノクローナル抗体であり、CD20の細胞外ドメインをターゲットとしています。結晶構造解析の結果によると、RituximabはCD20の細胞外ドメインのループ部分に存在する15アミノ酸残基の配列NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQと相互作用します。

真のコアとなるエピトープを同定するため、当該配列に基づいてデザインされたオーバーラッピングペプチドを配置したコンフォメーションエピトープマイクロアレイが作製されました。エピトープマッピングの結果として、コンセンサス配列EPANPSEKが得られました。

さらに詳細なエピトープに関する情報を得るため、CD20の細胞外ドメイン由来の配列1NIYNCEPANPSEK13の各位置のアミノ酸残基を他の19種類の標準アミノ酸で置換した1 アミノ酸残基置換スキャンが実施されました。
9N、10Pおよび11Sは高度に保存的であり、どのアミノ酸残基に置換してもほぼ完全にRituximabとの結合能を喪失しました。

6E、7P、8A、12Eは次に保存的であり、どのアミノ酸残基への置換においても50%以上の結合能の喪失を示しました。

13Kはほとんどのアミノ酸残基への置換で50%以上の結合能の喪失を示しましたが、Rへの置換では大きな結合能の喪失は示しませんでした。エピトープマッピングで同定された6EPANPSEK13の全体にわたり、配列が保存的であることがこれによって示されました。
これに対し、N末端側の配列1NIYNC5ではアミノ酸残基の置換は50%以下の結合能の喪失または結合能の増大を示しました。
これらを総合すると、6EPANPSEK13が真のエピトープである可能性が高いことが示唆されます。


野生型配列のCD20細胞外ドメインNIYNCEPANPSEKの1アミノ酸残基置換スキャンの結果(左)。各位置のアミノ酸残基は各アレイ領域の左からA~Y までのL-アミノ酸で置換されました。各行では置換されるアミノ酸残基の位置が固定されており、各列では置換後のアミノ酸残基が固定されています。
フレーム部分は抗FLAG抗体によって形成されています。アレイは100μg/mLの抗ヒトIgG(赤)および抗FLAGペプチド抗体(緑) で染色されました。
横に3分割された領域(サブアレイ) の対応する位置では、同一のペプチドが3重に配置されています。
下部のアレイはN 末端側の配列に対応しており、置換によらずRituximabとの反応が観測されているため、非保存的であることが示唆されています。これに対して上部のアレイはC 末端側の配列に対応しており、置換によって反応性に影響がみられることから、保存的であることが示唆されています。
この反応パターンは3つのサブアレイのスポット蛍光強度の平均に基づいて作成されたヒートマップの結果(右)でも確認できます。


アミノ酸残基置換スキャンの結果。元の配列における蛍光強度の値を100%として相対的な結合能を評価しています。


置換スキャンの結果は保存的配列および非保存的配列を識別することによるエピトープのバリデーションの他、変異による結合性の変化を評価することにも利用できます。これによって、患者集団を遺伝的要因でグループ分けし、レスポンダーとノンレスポンダーの予測やリスク評価等に活用できます。

また、様々なペプチド配列と抗体との結合性に関する評価データを得ることができるため、in silicoでの交差反応性予測に関する有用なデータとして活用することも可能です。