KaLy-Cell社 薬物動態試験

薬物代謝試験

KaLy-Cellではヒトまたは各種動物の新鮮または凍結肝細胞を使用した in vitro 薬物代謝試験を受託しております。

代謝安定性

薬物の代謝安定性は経口バイオアベイラビリティや血中半減期に影響を及ぼし、最終的には薬物の有効性にも大きな影響を与えます。KaLy-Cellでは確立した試験系(Blanchard et al. 2005, Desbans et al.,2014)を用いて肝細胞による薬物の代謝安定性を評価しております。この試験では親化合物の代謝による変換に伴う消失を測定します。

• LC/MSによる分析
• 浮遊状態で凍結または新鮮肝細胞を振とう培養し、4時間までの複数の時点で測定を行う（3重に測定）またはプレートで凍結または新鮮肝細胞を培養し、24時間までの複数の時点で測定を行う（3重に測定）
• 試験系の妥当性を検証するため、陽性対象化合物を使用した代謝物の測定を行う
  

種間の比較

肝臓における薬物代謝は種によって大きく異なり、薬物動態試験や毒性試験で最適な種を選定することはとても重要です。種間の薬物代謝の違いを評価するには、様々な実験動物由来の肝細胞を用いた in vitro 代謝試験を用いた試験を利用可能です。ヒトと各種動物の肝細胞を用いた代謝プロファイルを比較することによって、最も非臨床試験に適している動物種を選択することが可能です。

KaLy-Cellでは in vitro 種間薬物代謝比較試験サービスを受託しております。また、お客様社内で試験を実施される場合に、ヒトおよび種々の動物由来の肝細胞を提供しております。

表現型

薬剤候補化合物が人体によってどのように処理されるかを理解することは、潜在的な薬剤間相互作用を検討するために重要です。
KaLy-Cellでは最近凍結肝細胞の浮遊培養は、個々のサンプル間でのCYP活性にばらつきがある中で、P450による生体内での代謝産物の予測や薬物代謝速度の決定に有用であることを示しました。

薬物トランスポーター関連評価

KaLy-CellではQualystと提携し、肝臓における薬物の取り込み、排出、細胞内濃度、分布、肝毒性、クリアランスなどに関する確実な結果を得るべく努めております。Qualyst Transporter Solutionは他の肝臓モデルと比較して大きな優位性を持つ特許技術B-CLEARを使用した肝臓薬物トランスポーターが関連する評価のためのサービスおよび製品の独占的供給企業です。

In vivo との相関性の高い結果を得るためには実験の開始前に使用するシステムが全体として正しく機能していることを確認する必要があります。市場で入手可能な肝細胞は品質、性質、および機能の面で大きくばらつきがあります。KaLy-CellではTransporter Certified™凍結肝細胞として、B-CLEAR技術を利用して取り込みおよび排出トランスポーターの機能や代謝活性および形態に関して厳密な基準満たしていることがQualystによって確認された接着可能凍結肝細胞を販売しております。

酵素誘導

酵素誘導は併用して用いられる薬剤の代謝クリアランスを増加させ有効性を低下させます。その結果、併用療法の効果も低下します。FDAをはじめとする規制当局は酵素誘導は薬剤間相互作用の潜在的な要因と認識しています。
KaLy-Cellの酵素誘導試験は薬剤候補化合物による薬物代謝酵素の発現上昇を評価します。この試験は2種類のカテゴリーに分けられます。

• プライマリ肝細胞を用いて実施される薬剤候補化合物による in vitro 酵素誘導試験
• 薬剤を投与された動物由来の肝マイクロソームを用い、陽性対象化合物との酵素活性の比較を行う Ex vivo 試験
  

in vitro 酵素誘導

KaLy-Cellはヒト肝細胞を用いた in vitro 酵素誘導試験（FDAのゴールドスタンダードです）のエキスパートであり、FDAの推奨に準拠して実施しています。

酵素誘導は遺伝子発現の変動（qRT-PCRによるmRNAレベルの測定）または酵素活性の変動を肝細胞の in situ 分析または培養肝細胞由来マイクロソームの分析によって決定します。新鮮または凍結接着可能肝細胞を使用して試験を行います。

この2種類の細胞では誘導薬に対する反応性に大きな差がないことがKaLy-Cellの研究者の研究によって明らかになっています（Alexandre et al., 2012)。

さらにKaLy-Cellは新しい試験ガイドラインの確立を目的としてOECDに提出するためのSPSF(Standard Project Submission Form)に記載するために実施されている、薬剤のシトクロームP450誘導性を測定することによって肝臓における代謝産物生成および毒性の予測を行う試験系の施設間差のバリデーションにも参加しております(Abadie-Viollon et al., 2010; Richert et al., 2010)。

薬剤開発における酵素誘導試験

KaLy-Cellの標準的なアプローチは3ドナー由来のヒト肝臓からの肝細胞を用い、２または3日間で3種類以上の濃度の薬剤濃度（可能な場合は最大血漿Cmaxの10倍まで）で適当な陽性対象（β-naphthoflavone、phenobarbital、rifampin）と測定するものです。

細胞の形態変化とresazurinからresorufinへの変換が細胞毒性の指標として用いられます。CYP酵素（少なくともCYP1A2、CYP2B6、CYP3A4）、UGTおよびトランスポーター（例：P-glycoprotein）の発現変動はqRT-PCRを用いてmRNAレベルで測定されます。

以下に記載される通り、酵素活性は in situ 測定または肝細胞から調整されたマイクロソームで測定されます。

肝細胞中の酵素活性の in situ 測定：CYP活性の薬剤投与による変動はin situで評価可能です。この方法を採用することで、活性のデータを迅速にかつ安価に取得できます。KaLy-Cellではこの方法で得られた結果を、mRNAレベルでの発現結果の解釈のための補助的な情報として使用することを推奨しております。

マイクロソーム中の酵素活性測定：肝細胞から調製されたマイクロソームは各種CYPおよびUGTの酵素活性の測定に使用可能なだけではなく、メカニズムを調べる際に補助的役割を果たすウェスタンブロットによる解析にも使用可能です（例えばCYP3A4のような酵素の誘導が非可逆的な阻害によってマスクされているケースを特定したり、酵素活性の低下が酵素の阻害によるものか発現抑制によるものかを識別したりする場合）。mRNAレベルでの解析からもメカニズムに関する類似の情報を得ることができます。

マイクロソームを使用した酵素活性試験の優位な点は最初の解析が例えばCYP1A2、CYP2B6、CYP3A4に関してのみ実施された場合でも、FDAからの追加の試験、例えばCYP2Cに関する試験の要求に対して新たに肝細胞を培養することなく追加試験を実施可能であることが挙げられます。凍結保存されたマイクロソームを利用することで、結果に大きな影響を与えることなく後に追加の酵素活性の測定を行うことが可能です。

評価システム

KaLy-Cellは以下の様なin vitro評価システムを用いた酵素誘導評価を実施可能です。

• 新鮮接着可能ヒト肝細胞（マイクロソーム中または in situ での分析）
• 凍結接着可能ヒト肝細胞（マイクロソーム中または in situ での分析）
• CYPに関してバリデーション済みのLC-MS/MS
  

適切な陰性および陽性対照（既知の誘導薬）は観測される薬剤による酵素誘導の効率を客観的に評価するためにすべての酵素誘導試験で利用されています。

Ex vivo 酵素誘導

ラット、マウス、イヌ、サルを用いたEx vivo酵素誘導試験は薬剤候補化合物に関して、例えば酵素誘導性等の有益な情報を得るために利用できます。

また、得られたデータは臨床薬物間相互作用試験のデザインや薬物間相互作用のマグニチュードを推定するためにも使用できます。

• Phase IおよびPhase II薬物代謝パスウェイと自己誘導
• エピジェネティックながん形成
• ヒト臨床に近い毒性
• 薬物間相互作用
• 薬物動態

評価システム

薬剤処理された組織から調製したマイクロソーム

分析

• バリデーション済LC-MS/MS
• ハイスループットAgilent社オートサンプラー
• 内部標準を用いた解析
  

酵素阻害

シトクロームP450は薬剤の代謝に重要な役割を果たす酵素ファミリーです。併用投与の際に片方または両方の薬剤が相手方の代謝を阻害する可能性があるため、特定のシトクロームP450に対する薬剤による阻害を評価することは重要です。阻害によって生体内で血漿中の薬剤濃度が影響を受けたり、副作用が生じる可能性があります。

シトクロームP450阻害アッセイのためにKaLy-Cellでは凍結肝細胞と広く一般に受け入れられているプローブ化合物を使用しています。陰性対照と比較した場合のプローブ化合物の代謝物形成量の減少をもとにIC₅₀の計算が行われます。

可逆的酵素阻害

標準では7種類のP450アイソフォーム（CYP1A、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYO2C19、CYP2D6、CYP3A4。ご要望に応じ他のアイソフォームでも実施可能です。）の阻害効果がKaLy-Cellの実施するアッセイで評価されます。アイソフォーム特異的な基質がヒト浮遊肝細胞培養系に対して個々に様々な濃度（一般的には0.1～25μM）で添加されます。培養の終了時に代謝物の形成がLC-MS/MSで測定されます。

陰性対照と比較した場合のプローブ化合物の代謝物形成量の減少をもとにIC₅₀の計算が行われます。IC₅₀の決定に引き続き、特定のアイソフォームに対する化合物のKiを決定します。Kiは阻害の強さや阻害の形式（競合的、非競合的または混合）に関する情報を与えます。Ki値はまた in vivo での潜在的薬物間相互作用の影響について推定するためにも利用されます。
個々のアイソフォームアッセイに関して特定の既知の陽性対照を使用して試験を行います。

経時的酵素阻害

CYPの阻害は薬物間相互作用の最もよく起こる原因の一つです。阻害は可逆的、半可逆的および不可逆的のいずれのメカニズムでも起こり得ます。薬物相互作用に関するFDAのドラフトガイドライン(2012)およびEMAの薬物相互作用試験に関するガイダンス(2012修正)では薬剤の経時的な阻害を調べることが推奨されています。

k_inact/K_Iアッセイでは経時的な阻害の速度定数を決定します。k_inactは阻害剤の飽和濃度での酵素不活化に関する最大速度であり、K_Iは最大の50%の不活化速度を与える阻害剤濃度を示します。実験条件は別途行われる、例えばP450可逆的阻害アッセイやIC₅₀シフトの結果をもとに決定されます。

測定では、ヒト浮遊肝細胞を用いて、不活化が起こらない条件から最大の不活化が起こる条件まで網羅するため、7種類の評価対象化合物濃度（化合物添加無しを含む）で6つの異なる添加後培養時間（開始時を含む）における阻害を評価します。

その後、個々のアイソフォームに対するプローブ化合物を含んだバッファー（5×Km濃度）で希釈し、培養を行います。残存活性％の対数と評価対象化合物との培養時間を直線で近似した際の傾きを算出するために最小二乗法で回帰分析を行い、その後阻害剤濃度に対する傾きの関係を非線形回帰分析で決定することによって_kinactとK_Iが算出できます。