ペルオキシダーゼ基質

ペルオキシダーゼは酵素イムノアッセイに最もよく用いられる酵素で、中でも最も有名なのは西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase, HRP)です。ELISAのような古典的なイムノアッセイにおいて、生成した発色量は、HRPの局所濃度の指標であり、したがって一次抗体の標的又は核酸ハイブリダイゼーションプローブを測定することが可能です。

ペルオキシダーゼとは

ペルオキシダーゼは酵素イムノアッセイに最もよく用いられる酵素で、中でも最も有名なのは西洋ワサビペルオキシダーゼ(HorseRadish Peroxidase, HRP)です。過酸化水素は電子供与体存在下でペルオキシダーゼによって水に変換されます。

このとき電子供与体として適当な酸化発色基質を用いることで、過酸化水素量を発色量として観測できます。数値は目的成分（基質）の存在量に比例します。ELISAのような古典的なイムノアッセイにおいて、生成した発色量は、HRPの局所濃度の指標であり、したがって一次抗体の標的又は核酸ハイブリダイゼーションプローブを測定することが可能です。

さらにHRPは、プローブ内の異なる他の低分子基質の濃度を検出に応用することが可能です。多数の酸化酵素が、このような系で活性を示すことが既に知られています。ほとんどのオキシダーゼは、目的の物質を変換して過酸化水素を生成します。したがって目的とする物質の濃度は生成する過酸化水素の濃度に比例します。

H2O2の濃度は、HRPと発色基質によって測定することが可能です。

ペルオキシダーゼ検出のための基質

3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, TMB）はペルオキシダーゼ検出のための発色基質であり、一般にEIAプレートまたはブロッティング用メンブレンフィルターに用いられます。

TMBは過酸化水素およびペルオキシダーゼの存在下で酸化され、655 nmに吸収極大を持つ青緑色二量体を形成します。

必要に応じて、1~2Mの硫酸を加えることで色を青から黄色に変換し、吸光度を倍増することも可能です。

TMBは非常に発癌性の高いo-ヒドロキシベンジジン(o-hydroxybenzidines)やo,o’-ジヒドロキシベンジジン(o,o’-dihydroxybenzidines)に代謝される通常のベンジジンを代替することが可能です。

TMBのオルト位はメチル基で置換されているため、ベンジジンのように代謝されることなく非常に有害性の少ない化合物です。TMBは難水溶性の塩基や水に容易に溶解する塩酸塩(1％(w/v))などの形で入手可能です。

3,3’-ジアミノベンジジン(3,3’-Diaminobendizine,DAB)はイムノブロッティング法および免疫組織染色で最も一般的に使用される西洋ワサビペルオキシダーゼの基質の一つです。

この基質は酸化されると容易に肉眼で観察可能な不溶性で褐色の沈殿物を生成します。


表1. ペルオキシダーゼ検出のための基質 製品リスト
コード 製品名 分子式 CAS 分子量 内容量 名称
LS-3250.0010 TMB C16H20N2 54827-17-7 240.34 10g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, free base
LS-3250.0025 TMB C16H20N2 54827-17-7 240.34 25g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, free base
LS-3250.0100 TMB C16H20N2 54827-17-7 240.34 100g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, free base
LS-3255.0005 TMB*2HCl C16H20N2*2HCl 207738-08-7 240.34*72.90 5g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, dihydrochloride hydrate
LS-3255.0010 TMB*2HCl C16H20N2*2HCl 207738-08-7 240.34*72.90 10g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, dihydrochloride hydrate
LS-3255.0050 TMB*2HCl C16H20N2*2HCl 207738-08-7 240.34*72.90 50g 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, dihydrochloride hydrate
LS-3260.0010 DAB C12H14N4 91-95-2 214.27 10g 3,3'-Diaminobenzidine
LS-3260.0025 DAB C12H14N4 91-95-2 214.27 25g 3,3'-Diaminobenzidine
LS-3260.0050 DAB C12H14N4 91-95-2 214.27 50g 3,3'-Diaminobenzidine
LS-3260.0100 DAB C12H14N4 91-95-2 214.27 100g 3,3'-Diaminobenzidine
LS-3260.0250 DAB C12H14N4 91-95-2 214.27 250g 3,3'-Diaminobenzidine
LS-3265.0025 DAB*4HCl C12H14N4*4HCl 7411-49-6 214.27*145.81 25g 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride
LS-3265.0100 DAB*4HCl C12H14N4*4HCl 7411-49-6 214.27*145.81 100g 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride
LS-3265.0250 DAB*4HCl C12H14N4*4HCl 7411-49-6 214.27*145.81 250g 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride

参考文献

▶ Holland V.R. et al., A Safer Substitute for Benzidine in the Detection of Blood. Tetrahedron 1974; 30: 3299-3302.

▶ Martin T.L. et al., The light side of horseradish peroxidase histochemistry. J. Histochem. Cytochem. 1984; 32 (7): 793.

▶ Pujol F.H. et al., A Double Sandwich Monoclonal Enzyme Immunoassay for Detection of Hepatitis B Surface Antigen. J. Immunoassay 1993; 14: 21-31.

▶ Herzog V., Fahimi H.D., A new sensitive colorimetric assay for peroxidase using 3,3’-diaminobenzidine as hydrogen donor. Anal. Biochem. 1973; 55 (2): 554-62.

H2O2検出のための基質 -トリンダー試薬-

P.Trinderはオキシダーゼ/ペルオキシダーゼテストの仕組みを利用して1960年代に血糖値の試験法を確立しました。この試験は主に2段階の機構で表すことができます。

第1のステップでは、グルコースオキシダーゼによって触媒されるグルコースのグルクロン酸への酸化反応過程で過酸化水素が生成します。

第2のステップでは、この過酸化水素が西洋ワサビペルオキシダーゼにより還元される一方、フェノールが酸化され4-アミノアンチピリン（4-aminoantipyrine）と反応し、最終的にキノンイミン色素を形成します。

このとき色の強度は、最初のグルコース濃度に正比例します。

最近では、優れた特性を持つ “新しいTrinder試薬”（Novel Trinder’s reagent, NTR）が古典的なTrinder試薬に置き換わっています。

新しいTrinder試薬は、基質の水溶性および安定性に寄与するプロピルスルホン酸またはヒドロキシプロピルスルホン酸がアミノ基に結合したアニリン類縁体です。

4-アミノアンチピリンへの酸化的カップリングを経て、540～630nmの範囲に吸収極大を持つ安定した色素を形成します。

これらNTRは、溶液中および試験紙を用いた検出系の両方において利用可能な程度に安定です。


表2. トリンダー試薬関連製品リスト
コード 製品名 分子式 CAS 分子量 内容量 名称
LS-3270.0002 ADPS C12H18NNaO4S 82611-88-9 295.33 2g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt
LS-3270.0005 ADPS C12H18NNaO4S 82611-88-9 295.33 5g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt
LS-3270.0010 ADPS C12H18NNaO4S 82611-88-9 295.33 10g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline sodium salt
LS-3275.0005 ALPS C11H16NNaO3S 82611-85-6 265.31 5g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline sodium salt
LS-3275.0010 ALPS C11H16NNaO3S 82611-85-6 265.31 10g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline sodium salt
LS-3275.0025 ALPS C11H16NNaO3S 82611-85-6 265.31 25g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline sodium salt
LS-3275.0050 ALPS C11H16NNaO3S 82611-85-6 265.31 50g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline sodium salt
LS-3275.0100 ALPS C11H16NNaO3S 82611-85-6 265.31 100g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline sodium salt
LS-3280.0001 DAOS C13H20NNaO6S 83777-30-4 341.36 1g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3280.0005 DAOS C13H20NNaO6S 83777-30-4 341.36 5g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3280.0025 DAOS C13H20NNaO6S 83777-30-4 341.36 25g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3285.0005 HDAOS C11H16NNaO6S 82692-88-4 313.3 5g N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3285.0025 HDAOS C11H16NNaO6S 82692-88-4 313.3 25g N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3285.0050 HDAOS C11H16NNaO6S 82692-88-4 313.3 50g N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt
LS-3290.0001 MADB C16H25NNa2O6S2 209518-16-1 437.48 1g N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, disodium salt
LS-3290.0005 MADB C16H25NNa2O6S2 209518-16-1 437.48 5g N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, disodium salt
LS-3290.0010 MADB C16H25NNa2O6S2 209518-16-1 437.48 10g N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, disodium salt
LS-3290.0025 MADB C16H25NNa2O6S2 209518-16-1 437.48 25g N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, disodium salt
LS-3295.0001 MAOS C13H20NNaO4S*H2O 82692-97-5 309.36*18.02 1g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate
LS-3295.0005 MAOS C13H20NNaO4S*H2O 82692-97-5 309.36*18.02 5g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate
LS-3295.0010 MAOS C13H20NNaO4S*H2O 82692-97-5 309.36*18.02 10g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt monohydrate
LS-3305.0050 TOOS C12H18NNaO4S*2H2O 82692-93-1 295.33*36.04 50g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate
LS-3305.0100 TOOS C12H18NNaO4S*2H2O 82692-93-1 295.33*36.04 100g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate
LS-3305.0250 TOOS C12H18NNaO4S*2H2O 82692-93-1 295.33*36.04 250g N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt dihydrate
LS-3310.0100 TOPS C12H18NNaO3S 40567-80-4 279.33 100g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt
LS-3310.0250 TOPS C12H18NNaO3S 40567-80-4 279.33 250g N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt
LS-3310.1000 TOPS C12H18NNaO3S 40567-80-4 279.33 1kg N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt
LS-3315.0500 4-Aminoantipyrine C11H13N3O 83-07-8 203.24 500g 4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazoline-5-one
LS-3315.1000 4-Aminoantipyrine C11H13N3O 83-07-8 203.24 1kg 4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazoline-5-one
LS-3315.2000 4-Aminoantipyrine C11H13N3O 83-07-8 203.24 2kg 4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazoline-5-one

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