クリックケミストリーのアミノ酸への応用

組み換えによるタンパク質へのアミノ酸の導入

クリックケミストリーのアミノ酸への応用
図.1 クリックケミストリーのアミノ酸への応用

変異体または修飾アミノアシル tRNA合成酵素(aaRS)を使用することで、対応するtRNAに非天然アミノ酸を結合させ、組み換え合成の間にポリペプチドまたはタンパク質中へ非天然アミノ酸を取り込ませることが可能です。

アジドホモアラニン(Aha)はメチオニン(Met)の構造的な類縁体であり、大腸菌の生来のメチオニル tRNA合成酵素によってタンパク質中のMetをAhaと効果的に置き換えることができます。

基質特異性を変化させた酵母フェニルアラニルtRNA合成酵素は、α-サブユニットへのT415GまたはT415Aといった変異の導入によって作製されます。

トリプトファニル tRNA合成酵素およびメチオニルtRNA合成酵素中の結合アミノ酸特異的残基も同定されており、導入する変異によっては非天然アミノアシルtRNA分子に対して特異性を持つようになります。

リジンはピロリジル- tRNA合成酵素によってアジド類縁体およびプロパルギル類縁体を結合することができ、タンパク質中に部位特異的なアジド基またはアルキニル基を導入し、クリック結合に供することが可能になります。

タンパク質中に多数のクリック反応基を特異的に取り込ませるため、現在も研究開発が継続されています。アジド基がタンパク質配列の中に組み込まれた後は、様々な相手と結合することが可能であり、可能性が広がります。

PEGポリマー、色素、コファクター、抗体、低分子化合物、毒素、他のタンパク質およびペプチドとの結合によって、治療や診断を含む様々な応用が可能です。


組み換えによるタンパク質へのアミノ酸の導入
図.2 組み換えによるタンパク質へのアミノ酸の導入

ケミカルプローブを用いたタンパク質ラベリングのためのプロトコル

1.
対象となるタンパク質混合物サンプルをPBSで2mg/mL となるように希釈します。
2.
エッペンドルフチューブに希釈した2mg/mL のプロテオーム溶液を500 μL分注します。
3.
濃縮DMSOストックから1~20μMのアルキン化したサイト特異的なケミカルプローブをチューブに添加します。500 μL反応液中のDMSO量が10 μLを超えないようにしてください。プローブの添加後にボルテックスで撹拌して室温で1時間放置してください。
4.
純水にTCEP(LS-3405)を溶解して50 μM溶液を調製し (14.4mg/mL )、DMSO:tBuOH=1 :4 混合液中にCu(I)安定化剤TBTAのストック溶液を混合し、1.7 mM溶液を調製します(0.9mg/mL )。TCEPは4℃のアルゴン雰囲気下で保存します。水溶液は使用する たびに新たに調製してください。
5.
精製または検出用タグ溶液(6mM DMSOストック溶液)を11.6 μLチューブに添加し、ボルテックスで撹拌します。
6.
ボルテックスで撹拌せずに、4で調製した11.6 μLの新鮮なTCEP溶液をチューブに添加します。
7.
4で調製した35 μLのリガンド溶液をチューブに添加し、ボルテックスで撹拌します。
8.
硫酸銅(ll)(50 mM水溶液ストック(12.5mg/mL )) 11.6 μLをチューブに添加しボルテックスで撹拌します。
9.
室温で1時間チューブを放置します(30分後にボルテックスで一度撹拌)。この段階でタンパク質は沈殿し始め、溶液は濁ってきます。
10.
6,500g、4℃で4分間遠心分離します。タンパク質ペレットが形成されます。
11.
上清を除去して、冷MeOH を500 μL添加し、3~4秒間超音波で処理します。(タンパク質ペレットの洗浄のためのMeOHは使用の前に氷上で確実に冷却してください。冷却されていないMeOHを使用するとペレットからタンパク質が失われます。)
12.
4 ℃で10分間振とうし、6,500g、4℃で4分間遠心分離します。
13.
上清を除去し、500μLの冷MeOHによる洗浄(ステップ11および12)を反復します。
14.
上清を除去し、1.2%のSDS/PBSを1mL 添加し、3~4秒間超音波で処理した後80~90℃で5分間加熱します。
15.
15 mLのコニカルチューブに溶液を移し、 SDSが0.2%となるよう5mL のPBSで希釈します。
16.
サンプルは - 80℃ で数日間保存できます。

詳細は下記文献をご参照ください。

▷ Tandem orthogonal proteolysis-activity-based protein profiling (TOP-ABPP)-a general method for mapping sites of probe modification in proteomes; Eranthie Weerapana,An na E.Sp eers and Benjamin F. Cravatt; NATURE PROTOCOLS, 2007; 2(6): 1414-1425; D01:10.1038/nprot.2007.194.

TCEP*HCl

表.1 TCEP*HCl製品

参考文献

▷ Incorporation of Azides into Rrecombinant Proteins for Chemoselec-tive Modification by the Staudinger ligation; Kristi L. Kiick, Eliana Saxon,David A. Tirrell, and Carolyn R. Bertozzi;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;99: 19. ▷ Patent: WO 2007103307 ▷ High-Throughput Screening for Methionyl-tRNA Synthetases that Enable Residue-Specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Recombinant Proteins in Bacterial Cells; Tae Hyeon Yoo and David A. Tirrell; Angew. Chem. Int. Ed. 2007; 46: 5340‒5343; DOI: 10.1002/anie.200700779. ▷ Global Replacement of Tryptophan with Aminotryptophans Genera-tes Non-Invasive Protein-Based Optical pH Sensors; Nediljko Budisa, Marina Rubini, Jae H. Bae, Elisabeth Weyher, Waltraud Wenger, Ralph Golbik, Robert Huber, Luis Moroder; Angew. Chem. Int. Ed. 2002; 41(21): 4066-4069. ▷ Genetic Encoding and Labeling of Aliphatic Azides and Alkynes in Recombinant Proteins via a Pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) Pair and Click Chemistry; Duy P. Nguyen, Hrvoje Lusic, Heinz Neu-mann, Prashant B. Kapadnis, Alexander Deiters, and Jason W. Chin; J. Am. Chem. Soc.2009;131: 8720-8721. ▷ Direct charging of tRNACUA with pyrrolysine in vitro and in vivo; Blight Sherry et. al; Nature 2004; 431: 333-335.

アジド化およびアルキン化アミノ酸を使用したペプチド合成

α-ヘリックス型二次構造の安定化
図.3 α-ヘリックス型二次構造の安定化
m+n=4 または7の場合、非天然構造または不規則構造、m+n=5または6の場合、規則的な2次構造を取ります。

アジド化アミノ酸およびアルキン化アミノ酸両方のBoeまたはFmoc保護誘導体が入手可能であり、これらを標準的な方法、例えばSPPSプロトコル等を用いてペプチド配列の中へ組み込むことができます。α-ヘリックス型二次構造中で、位置iおよび位置i+4のアミノ酸は立体構造上互いに近接して存在します。それらがアルキニル基およびアジド基をそれぞれ保有する場合、これらの基は互いに接近し、対応する1,2,3-triazol部分構造を形成し、α-ヘリックス型コンフォメーションにおいて二次構造を安定化する環化付加反応が起こります。1,2,3-triazol架橋が5個または6個のメチレン基を保有する場合はペプチドが規則的で安定な二次構造を示すということは、ノナペプチド[1、2]で実証されています。しかしながら、環サイズがこれより小さかったり(m+n=4)、逆に大きかったり(m+n=7)する場合は、二次構造はむしろ不規則となリます。

二次構造の安定化は、例えばLysおよびAspのように、適切な位置での側鎖のラクタム形成によっても可能です。しかしながら、アジド化アミノ酸や参考文献:アルキン化アミノ酸を用いた場合の方が合成の容易さとコストの点で優れております。側鎖のラクタム形成のためにLysおよびAspの直交保護基を使用する場合、複雑なプロセスと高価なビルディングブロックが必要です。アジド基とアルキニル基は特異的に反応し、1,2,3-triazol環を生成します。副生成物および主生成物は通常のペプチド合成条件下で安定的かつ非反応性です。追加の保護ステップおよびその脱保護ステップは不要であり、1,2,3-triazolはタンパク質分解に関して安定です。生化学製品または医薬品の中に組み込まれる場合にこのことは非常に重要です。


クリック反応を利用したペプチド合成のためのプロトコル

すでに報告されているプロトコルを以下に示します。

まず、4 mLの tBuOH/H2O(1:2)に3µmoLのペプチドを溶解し、過剰料のアスコルビン酸(40 µmoL)およびCuSO4・5H2O(40 µmoL)加えることで in situでCu (I)を生成します。

その後室温で一晩撹拌し、続いて適切なクロマトグラフィー操作を行います。[3]


参考文献

▷ [1] CuI-Catalyzed Azide‒Alkyne Intramolecular i-to-(i+4) Side-Chain-to-Side-Chain Cyclization Promotes the Formation of Helix-Like Secondary Structures; Mario Scrima, Alexandra Le Chevalier-Isaad, Paolo Rovero, Anna Maria Papini, Michael Chorev, and Anna Maria D’Ursi; Eur. J. Org. Chem. 2010; 446‒457; DOI: 10.1002/ejoc.200901157. ▷ [2] Synthesis and Conformational Analysis of a Cyclic Peptide Obtained via i to i+4 Intramolecular Side-Chain to Side-Chain Azide-Alkyne 1,3-Dipolar Cycloaddition; Sonia Cantel, Alexandra Le Chevalier Isaad, Mario Scrima, Jay J. Levy, Richard D. DiMarchi, Paolo Rovero, Jose A. Halperin, Anna Maria D’Ursi, Anna Maria Papini, and Michael Chorev; J. Org. Chem. 2008; 73: 5663‒5674; DOI: 10.1021/jo800142s. ▷ [3] Side chain-to-side chain cyclization by click reaction; Alexandra Le Chevalier Isaad, Anna Maria Papini, Michael Chorev Paolo Rove-ro; J. Pept. Sci. 2009; 15: 451‒454; DOI 10.1002/psc.1141 ▷ [4] “Click” cyclized gallium-68 labeled peptides for molecular imaging and therapy: Synthesis and preliminary in vitro and in vivo evaluation in a melanoma model system; Molly E. Martin, M. Sue O’Dorisio, Whitney M. Leverich, Kyle C. Kloepping, and Michael K. Schultz; in: A Pathway to Personalized Diagnosis and Treatment Series: Recent Results in Cancer Research, 2012; 194: Richard P. Baum; Frank Rösch (Editors) 2012 ISBN 978-3-642-27993-5. ▷ [5] Improved synthesis and biological evaluation of chelator-modified -MSH analogs prepared by copper-free click chemistry; Nicholas J. Baumhover, Molly E. Martin, Sharavathi G. Parameswarappa, Kyle C. Kloepping, M. Sue O’Dorisio c, F. Christopher Pigge, Michael K. Schultz; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011; 21(19): 5757-61; DOI:10.1016/j.bmcl.2011.08.017.

アジド化アミノ酸製品一覧

アジドアラニン (Azido-Alanine)

表.2 アジドアラニン製品一覧

参考文献

▷ Mimicking ofDisulfide Bonds byTriazoles; Kai Holland-Nell and Morten Meldal; in: Proceedings of the 31st European Peptide Symposium; Michal Lebl, Morten Melda I, Knud J. Jensen, Thomas Hoeg-Jensen (Editors), European Peptide Society, 2010; 146 ▷ Peptide Tertiary Structure Nucleation by Side-Chain Crosslinking with Metal Complexation and Double "Click" Cycloaddition; Oscar Torres, Deniz Y'ksel, Matt Bernardina, Krishna Kumar, and Dennis Bong; ChemBioChem2008; 9: 1701-1705; DOI: 10. 1002/ cbic.200800040. ▷ "Click to Chelate": Synthesis and Installation of Metal Chelates into Biomolecules in a Single Step; Thomas L. Mindt, Harriet Struthers, Luc Brans, Todor Anguelov, Christian Schweinsberg, Veronique Maes, DirkTourwe, and Roger Schibli; J. Aa. Chem. Soc. 2006; 128: 15096-15097; DOI: 10.1021/ja066779f. ▷ Design, synthesis, and biological activity of novel triazole amino acids used to probe binding interactions between ligand and neutral amino acid transport protein SN 1; Mariusz Gajewski, Ben Seaver and C. Sean Esslinger; Bioorg. Med. Chem. Lett.2007;17: 4163-4166; 001:10.1016/j.bmcl.2007.05.061 ▷ Azidoalanine mutagenicity in Salmonella: effect of homologation anda-methyl substitution; Mangold, James B.; Mischke, Mark R.; Lavelle, James M.; Mutation Research, Environmental Mutagenesis and Related Subjects1989; 216(1) : 27-33.

アジドホモアラニン (Azido-Homoalanine)

表.3 アジドホモアラニン製品一覧

関連特許

▷ EP2190856 (A2), U52008096819 (A 1 ), W02009026393 (A2), WO2009026393 (A3), WO2006079364

参考文献

▷ Mild and Chemoselective Peptide-Bond Cleavage of Peptides and Proteins at Azido Homoalanine; Jaap Willem Back, Olivier David, Gertjan Kramer, Geraldine Masson, PiotrT. Kasper, Leo J. de Koning, Luitzen de Jong, Jan H. van Maarseveen, and Chris G. de Koster; Angew. Chem. Int. Ed. 2005; 44: 7946-7950; DOI: 10.1002/ anie.200502431 . ▷ ,,Clickable" elastins: elastin-like polypeptides functionalized with azide or alkyne groups; Rosalie L. M. Teeuwen; Sander S. van Berkel; Tim H. H. van Dulmen; Sanne Schoffelen; Silvie A. Meeuwissen; Han Zuilhof; Frits A. de Wolf; Jan C. M. van Hest; Chemical Communications 2009; 27: 4022-4024. ▷ Selective Enrichment of Azide-Containing Peptides from Complex Mixtures; Merel A. Nessen; Gertjan Kramer; Jaap Willem Back; Jeremy M. Baskin; Linde E. J. Smeenk; Leo J. de Koning; Jan H. van Maarseveen; Luitzen de Jong; Carolyn R. Bertozzi; Henk Hiemstra et al.; Journal of Proteome Research 2009; 8(7): 3702-3711 . ▷ Site-Specific Modification of Candida antarctica Lipase B via Residue-Specific Incorporation of a Non-Canonical Amino Acid; Sanne Schoffelen; Mark H. L. Lam berm on; Mark B. van Eldijk; Jan C. M. van Hest; Bioconjugate Chemistry 2008; 19(6): 1127-1131. ▷ Unnatural Amino Acid Incorporation into Virus-Like Particles; Erica Strable; Duane E. Prasuhn; Andrew K. Udit; Steven Brown; A. James Link; John T. Ngo; Gabriel Lander; Joel Quispe; Clinton S. Potter; Bridget Carragher et al.; Bioconjugate Chemistry 2008; 19(4): 866- 875. ▷ Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer; A. James Link; Mandy K. S. Vink; David A. Tirrell; Nature Protocols2007; 2(8): 1879-1883. ▷ Synthesis of the functionalizable methionine surrogate azido-homoalanine using Boc-homoserine as precursor; A. James Link; Mandy K. S. Vink; David A. Tirrell; Nature Protocols 2007; 2(8): 1884-1887. ▷ Presentation and detection of azide functionality in bacterial cell surface proteins; A. James Link; Mandy K. S. Vink; David A. Tirrell; J. Am. Chem. Soc. 2004; 126(34): 10598-10602. ▷ Expanding the diversity of chemical protein modification allows post-translational mimicry; Sander I. van Kasteren, Holger B. Kramer, Henrik H. Jensen, Sandra J. Campbell, Joanna Kirkpatrick, Neil J. Oldham, Daniel C. Anthony, Benjamin G. Davis; Nature2007; 446(26):1105-1109; DOl:10.1038/nature05757.


アジド-β-ホモアラニン (Azido-β-Homoalanine)

表.4 アジド-β-ホモアラニン


2-アミノ-3-アジド-酪酸 (2-Amino-3-Azido-Acid)

表.5 アジド-β-ホモアラニン

アジドによりマスクされたアミノ基

2-amino-3-azido-butanoic acidのアジド基は様々な用途に利用可能です。

アジドによりマスクされたアミノ基
図.4 アジドによりマスクされたアミノ基

1. アジド基はアミノ官能基へ還元することができるため、マスクされたアミノ基として働くことができます。反応に関する追加の直交性が必要となる場合、特に役に立ちます。アジドは、ピペリジンによる処理(Fmoc脱保護)、Pd(0)(Alloc除去)および酸性処理(Mtt、Trtまたは他の酸反応性基の切断)に対して安定的です。しかし、アジドは擬ハロゲン化物であるためHATUによってラセミ化が引き起こされるため、縮合反応には注意が必要です。 この問題はDIPEAの代わりに、コリジンまたは他非求核性塩基を使用して回避することができます。

2. 2-amino-3-azidobutanoic acidは、ペプチドまたは他の有機分子のアルキニル基との間に任意のタイプのクリック結合を形成するために使用できます。

3. キラルなα,β-ジアミンおよびジアミノ酸は、天然物や上市されている薬剤中によく見られ、有機合成において標的とされる機能モチーフとなることが増えています。例えば、ビオチン、ペニシリンおよび抗インフルエンザ作用のあるノイラミニダーゼ阻害剤タミフルなどで見られます。キラルな隣接ジアミンおよびそれらの金属錯体は立体選択的有機合成において、特に触媒的不斉合成におけるキラル補助基およびリガンドとして、用いられています。


参考文献

▷ α,β-Diamino Acids: Biological Significance and Synthetic Approaches; Alma Viso, Roberto Fernandez de la Pradilla, Ana Garcfa, and Aida Flores; Chemical Reviews 2005; 105(8): 3167-3196. DOI: 10.1021/ cr0406561 . ▷ Update 1 of:, α.β -Diamino Acids: Biological Significance and Synthetic Approaches; Alma Viso, Roberto Fernandez de la Pradilla, Mariola Tortosa, Ana Gard a, and Aida Flores; Chem. Rev. 201 1; 1 1 1 : PR1-PR42. DOI 10.1021/crl 00127y. ▷ Orthogonally Protected Cyclo-β-tertapeptides as Solid-Supported Scaffolds for the Synthesis of Glycoclusters; Pasi Virta, Marika Karskela, Harri Lonnberg; J.Org.Chem 2006; 71: 1989-1999. ▷ Stereocontrolled Route to Vicinal Diamines by [3.3] Sigmatropic Rearrangement of Allyl Cyanate: Asymmetric Synthesis of anti( 2R,3R)-and syn-(2R,3S)-2,3-Diaminobutanoic Acids; Yoshiyasu Ichikawa, Haruka Egawa, Takashi Ito, Minoru lsobe, Keiji Nakano, and Hiyoshizo Kotsuki; Org.Lett. 2006; 8(25): 5737-5740. ▷ Efficient Synthesis of orthogonally protected anti-2,3-diamino acids; Stefania Capone, Annalisa Guaregna, Giovanni Palumbo, Silvana Pedatella; Tetrahedron 2005; 61 : 6575-6579.

アジドオルニチン (Azido-Ornithine)

表.6 アジドオルニチン製品一覧

参考文献

Application of Metal-Free Triazole Formation in the Synthesis of Cyclic RGDーDTPAConjugates; Sander S.va n Berke!, A. (Ton) J. Dirks, Silvie A. Meeuwissen, Dennis L. L. Pingen, Otto C. Baerman, Peter Laverman, Floris L. van Delft, Jeroen」.L. M.Co rnelissen, and Floris P.J.T. Rutjes; ChemBioChem 2008; 9: 1805ー1815;001:10.1002/ cbic.200800074.

アジドリシン (Azido-Lysine)

表.7 アジドリシン製品一覧


アジドプロリン (Azido-Proline)

表.8 アジドプロリン製品一覧


アジドフェニルアラニン (Azido-Phenylalanine)

表.9 アジドフェニルアラニン製品一覧


アジドチロシン (Azido-Phenylalanine)

表.10 アジドチロシン製品一覧


様々なアジド化アミノ酸-OHを利用したペプチド合成の参考文献

Improved Solid-Phase Peptide Synthesis Method Utilizing r-Azide- +Protected Amino Acids; Joseph T. Lundquist, IV and Jeffrey C. PelletierOrganic Lett. 2001; 3(5): 781-783. Azide reduction during peptide cleavage from solid-support - the choice of thio scavenger? P.E. Schneggenburger, B. Worbs, U. Diederich sen; J.Pept.Sci. 2010; 16(1 ): 10-14. Patent Publ. No. WO/2005/116643; Identification of compounds modifying a cellular response; Morton Meldal et al. (2005). A DOTA-peptide conjugate by copper-free click chemistry; Molly E. Martin, Sharavathi G. Parameswarappa, M. Sue O'Dorisio, F. Christopher Pigge, Michael K. Schultz; Bioorg. Med. Chem. Lett. 201 O; 20: 4805-4807. Cul-Catalyzed Azide-Alkyne lntramolecular -to-( i +4) Side-Chainto- Side-Chain Cyclization Promotes the Formation of Helix-Like Secondary Structures; Mario Scrima, Alexandra Le Chevalier-lsaad, Paolo Rovero, Anna Maria Papini, Michael Chorev, and Anna Maria D'Ursi; Eur. J. Org. Chem. 2010; 446-457; DOI: 10.1002/ ejoc.200901157. Synthesis and Conformational Analysis of a Cyclic Peptide Obtained via i to i+4 lntramolecular Side-Chain to Side-Chain Azide-Alkyne 1,3-Dipolar Cycloaddition; Sonia Cantel, Alexandra Le Chevalier lsaad, Mario Scrima, Jay J. Levy, Richard D. DiMarchi, Paolo Rovero, Jose A. Halperin, Anna Maria D'Ursi, Anna Maria Papini, and Michael Chorev; J. Org. Chem. 2008; 73: 5663-5674; DOI: 10.1021/ jo800142s. Side chain-to-side chain cyclization by click reaction; Alexandra Le Chevalier lsaad, Anna Maria Papini, Michael Chorev and Paolo Rovero; J. Pept. Sci. 2009; 15: 451-454; DOI 10.1002/psc.1141 An efficient peptide ligation using azido-protected peptides via the thioester method; Hidekazu Katayama, Hironobu Hojo, Tsuyoshi Ohira, Yoshiaki Nakahara; Tetrahedron Letters 2008;49(38): 5492-5494.

アルキル化アミノ酸と関連誘導体

アルキン化試薬

表.11 アルキン化試薬製品一覧


プロパルギルグリシン (Propagylglycine)

表.12 プロパルギルグリシン製品一覧


プロパルギルアラニン (Propagylalanine)

表.13 プロパルギルアラニン製品一覧


プロパルギルシステイン (Propagylecystein)

表.14 プロパルギルシステイン製品一覧

Boc-L-Cys(propargyl)-OHの利用例に関する参考文献

▷ Photoinduced Addition of Glycosyl Thiols to Alkynyl Peptides: Use of +Free- Radical Thiol-Yne Coupling for Post-Translational Double-Glycosylation of Peptides; Mauro Lo Conte, Salvatore Pacifico, Angela Chambery, Alberto Marra and Alessandro Dondoni; J. Org. Chem. 2010;75: 4644. ▷ Neoglycopeptides through direct functionalization of cysteine; Christine Vala, Fran~oise Chretien, Eva Balentova, Sandrine LamandeLangle and Yves Chapleur;Tetrahedron Lett. 2011;52(1): 17-21


プロパルギルリシン (Propagyllysine)

表.15 プロパルギルリシン製品一覧


プロパルギルセリン (Propagylserine)

表.16 プロパルギルセリン製品一覧

Boc-L-Ser(propargyl)-OHの利用例に関する参考文献

▷ lsoxazolyl-Serine-Based Agonists of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor: Design, Synthesis, and Effects on Cardiomyocyte Differentiation; Zhi-Liang Wei et al.; J. Am. Chem. Soc. 2004; 126: 16714. ▷ Lacosamide lsothiocyanate-based Agents: Novel Agents to Target and Identify Lacosamide Receptors; Ki Duk Park et al.; J. Med. Chem. 2009;52: 6897.


プロパルギルチロシン (Propagyltyrosine)

表.17 プロパルギルチロシン製品一覧


プロパルギルトリプトファン (Propagyltrypthophane)

表.18 プロパルギルトリプトファン製品一覧