クリックケミストリーを利用したDNA修飾

DNA修飾への応用とその手順

クリック化合物は通常の生体物質とは反応しない特性があるため、オリゴヌクレオチド合成においても非常に有用です。前処理や精製の必要がない、または必要がある場合でも単純な過程で済む点は化合物のさらなる長所と言えます。しかしながら、Cu触媒を用いる方法は銅イオンがDNAを損傷しストランドの切断を引き起こすたため、DNAの修飾のための用途では使用例が限られていました。

これらの問題が銅(I)安定化リガンド(例えばtris(benzyltriazolylmethyl)amineやTBTA[2])の使用によって克服され、CarellらおよびSeelaらは、非常に高い効率でアルキン修飾DNA核酸塩基に官能機を付与するためにCuAAC反応を使用できることを見い出しました[3-5]。DNAクリック化合物を用いることで、広範囲に渡る応用が可能になります。


DNAおよびRNAの標識:アルキン化ホスホアミダイトの取り込みとアジド化マーカーによる標識[8]
PCRアッセイ、PCRプライマー、およびその他のヌクレオチド混合物中に組み込んだアルキン化三リン酸による断片の修飾とアジド化マーカーによるPCR断片の標識[8]
DNA合成前後の修飾のための多重標識プライマーとしてのオリゴヌクレオチド
FISHプローブとして、およびFISH実験での使用アルキン化オリゴヌクレオチドの使用とアジドマーカーによる標識
DNAおよびRNAのPEG化
修飾されたホスホアミダイト、ヌクレオシド3リン酸塩またはオリゴヌクレオチドを用いたマイクロアレイ
ナノ粒子や生体物質との結合

参考文献

▷ [1] Oxidative Nucleobase Modifications Leading to Strand Scission; C. J. Burrows and J. G. Muller; Chem Rev 1998; 98: 1109-1152. ▷ [2] Polytriazoles as copper(I)-stabilizing ligands in catalysis; T. R. Chan, R. Hilgraf, K. B. Sharpless and V. V. Fokin; Org Lett 2004; 6: 2853-5. ▷ [3] Click chemistry as a reliable method for the high-density post-synthetic functionalization of alkyne-modified DNA; J. Gierlich, G. A. Burley, P. M. Gramlich, D. M. Hammond and T. Carell; Org Lett 2006; 8: 3639-42. ▷ [4] DNA containing side chains with terminal triple bonds: Base-pair stability and functionalization of alkynylated pyrimidines and 7-deazapurines; F. Seela and V. R. Sirivolu; Chem Biodivers 2006; 3: 509-14. ▷ [5] Click-click-click: single to triple modification of DNA; P. M. Gram-lich, S. Warncke, J. Gierlich and T. Carell; Angew Chem Int Ed Engl 2008; 47: 3442-4. ▷ [6] New labelling strategies for the sensitive detection of analytes; Patent WO2006/117161 ▷ [7] Nucleosides and Oligonucleotides with Diynyl Side Chains: Base Pairing and Functionalization of 2‘-Deoxyuridine Derivatives by the CuI-Catalyzed Alkyne-Azide “Click’’ Cycloaddition; F. Seela, V. R. Sirivolu, Helv. Chim. Acta, 2007: 90, 535. ▷ [8] Synthesis of highly modified DNA by a combination of PCR with alkyne-bearing triphosphates and click chemistry; J. Gierlich, K. Gutsmiedl, P. M. Gramlich, A. Schmidt, G. A. Burley and T. Carell; Chemistry 2007; 13: 9486-94.

公開されているDNA修飾法におけるクリックケミストリーの利用例

これらのプロトコルはさらに最適化して利用できます。

クリック反応用溶液の調製

本プロトコールで調製する溶液は使用するごとに新たに調製してください。

1.
70µLの3:1のDMSO/ t-BuOH混合液中に1 mg CuBrを溶解して0.1M溶液を調製します。この溶液は新たに調製し、保存しないでください。この溶液は-20℃で保存可能です。
2.
0.1M TBTA溶液の2体積に0.1M CuBr溶液の1体積を迅速に添加して、「クリック反応用溶液」を調製します。

短鎖DNAのためのクリック反応

1.
5 µLの2 mM DNA水溶液(10 nmol)へ、5 µLのアジド溶液(10 mM, 50 nmol, 5当量)と3:1のDMSO/ t-BuOH混合溶液中に溶解した0.1 M CuBrおよび0.1M TBTAリガンドを1:2の比で混合することによって新たに調製した溶液3 µLを添加します。完全に混合し、25℃で3~4時間振盪します。
2.
続いて反応物を0.3 M NaOAc (100 µL)で希釈し、1 mLの冷EtOHを使用してDNAを沈殿させます。次いで上清を除去し、残留物を1 mLの冷EtOHで2回洗浄します。洗浄した残留物を純水 (20 µL)中に再溶解します。精製不要ですのでそのまま使用できます。

CuBrを用いた方法についての考察

標識反応は、アルキン化オリゴおよびアジド化標識化合物の濃縮された溶液を用いてより効率的に行うことができます。クリック反応を実行するうえで最適な方法は、最小限の量の溶媒中でアルキン化オリゴおよびアジド標識化合物を混合することです (アルキン/アジド比が1:2~1:10、1:10は高密度の標識が飛鳥な場合)。

反応は恒温によって通常加速され、反応温度が40 ~ 45 ℃付近の場合、30分未満で完了します。


代替のCu(I)源を使用するクリック反応

1.
25 µLの0.5 mM DNA水溶液 (12.5 nmol) へ、6.25 µLのアジド溶液 (0.1 N、625 nmol) ならびに4:3:1の水/DMSO/ t-BuOH混合液中に1:2の比でCu(II)塩(CuSO4) およびTBTAリガンドを溶解した10 µLの溶液 (0.05 N、250 nmol) を添加します。
2.
混合物をボルテックスで撹拌し、新たに調製した5 µLのtris-(2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP) 水溶液を添加します (0.1 N、500 nmol)。
3.
溶液を15℃で一晩振盪し、続いて蒸留水 (200 µL) により希釈し、精製せずにゲル電気泳動にかけます。TCEPの代わりに、アスコルビン酸ナトリウムも使用できます。

300 bpのPCR産物のためのクリック反応

1.
10 µLのDNA溶液 (1 ~ 4 pmol DNA、10 mM Tris)へ、10 µLのフルオレセインアジド溶液 (5 mM、0.1 N DMSO溶液のストックから5% t-BuOHを含有する10 mM Trisで希釈し調製) および10 µLの半錯体形成したCu(I) (10 mM; 1 mgのCuBr (99.99%)を700 µLの1:3の t-BuOH/DMSOに添加し、サンプルを37℃で2時間振盪します。)
2.
ついでホルムアミドバッファーを添加し、5%PAGEゲルを使用してサンプルを解析します。実験では、反応は30分未満で完了することが示されました。

クリックケミストリーを利用したDNA修飾に関するその他の参考文献

▷ A Programmable DNA-Based Molecular Valve for Colloidal Mesopo-rous Silica. A. Schlossbauer, S. Warncke, P. M. E. Gramlich, J. Kecht, A. Manetto, T. Carell, T. Bein, Angew. Chem. Int. Ed. 2010; 49: 4734-4737 ▷ Click Chemistry with DNA. A. H. El-Sagheer, T. Brown, Chem. Soc. Rev. 2010; 39: 1388-1405. ▷ Click Chemistry as a Reliable Method for the High-Density Post-synthetic Functionalization of Alkyne-Modified DNA. J. Gierlich, G. A. Burley, P. M. E. Gramlich, D. M. Hammond, T. Carell, Org. Lett. 2006; 8: 3639‒3642. ▷ Direct DNA Metallization. G. A. Burley, J. Gierlich, M. R. Mofid, S. T. H. Nir, Y. Eichen, T. Carell, J. Am. Chem. Soc. 2006; 128: 1398-1399. ▷ DNA Containing Side Chains with Terminal Triple Bonds: Base Pair Stability and Functionalization of Alkynylated Pyrimidines and 7-Deazapurines. F. Seela, V. Ramana Sirivolu, Chemistry & Biodiver-sity 2006; 3: 509. ▷ DNAPhotography: An Ultrasensitive DNA-Detection Method Based on Photographic Techniques. D. M. Hammond, A. Manetto, J. Gier-lich, V. A. Azov, P. M. E. Gramlich, G. A. Burley, M. Maul, T. Carell, Angew. Chem. Int. Ed. 2007; 46: 4184-4187. ▷ Pronounced Effect of DNA Hybridization on Click Reaction Efficien-cy. C. T. Wirges, P. M. E. Gramlich, K. Gutsmiedl, J. Gierlich, G. A. Burley, T. Carell, QSAR Comb. Sci. 2007; 26: 1159‒1164. ▷ Postsynthetic DNA Modification through the Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition Reaction. P. M. E. Gramlich, C. T. Wirges, A. Manetto, T. Carell, Angew. Chem. Int. Ed. 2008; 47: 8350-8358. ▷ Click Chemistry and Oligonucleotides: How a simple reaction can do so much. F. Morvan, A. Meyer, G. Pourceau, S. Vidal, Y. Chevolot, E. Souteyrand, J.-J. Vasseur Nucleic Acids Symposium Series 2008; 52: 47-48.

DNA修飾用クリックケミストリー試薬

表.1 DNA修飾用クリックケミストリー試薬