チオール-PEG

リポアミド-PEG

ナノテクノロジー/バイオナノテクノロジーにおいて、金及び銀のナノ粒子のナノ粒子の応用範囲は量子ドットや磁気粒子など年々広まっており、診断薬をはじめ、治療、センサーなど多岐に渡ります。金属粒子はそのままでは水溶性を持ちませんが、チオールを用い修飾することで自己組織化単分子膜を形成し、もう一方の末端を用いてタンパク質など別の分子を結合させることが可能です。

モノチオールはDTTによって容易に分解することが可能です。二つのSを持つリポ酸（チオクト酸）はこれよりもさらに強力な結合を有し、DTTなどモノチオールを分解する条件に対して耐性を持ちます。

リポアミド-PEG-カルボン酸およびリポアミド-PEG-アルコールは金属表面に配位させ、金属粒子と他の生体分子等をつなげる役割を果たします。単分子膜の表面の官能基の密度を下げるには、メトキシ-PEG-チオールを併用して表面を修飾します。この手法はタンパク質等の大きな分子を結合するためには有用な手法です。また、リポ酸はチオールほどのにおいを持ちません。

手順例

リポ酸をジヒドロリポ酸に還元する手法は様々な文献でその情報を得ることが可能ですが、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）および水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）はその代表として挙げられます。細かい条件は個々のリポ酸ごとに最適化する必要がありますが、一般的にTCEPは水系（リン酸系バッファーを除く）でも扱うことができ、リポ酸に対して3等量以上を加え、25 ℃から50 ℃で1-2時間のうちに反応が終了します。

参考文献

▷ Bioconjugate Techniques; G. T. Hermanson; 2nd Edition;Elsevier 2008; 188-190, 485-497, 924-935; ISBN 978-0-12-370501-3

▷ Self-assembled organic monolayers: model systems for studying adsorption of proteins at surfaces; K. Prime and G. Whitesides; Science 1991; 252: 1164-1167. doi:10.1126/ science.252.5009.1164

▷ Biosensing with Luminescent Semiconductor Quantum Dots;K. Sapsford, T. Pons, I. Medintz and H. Mattoussi; Sensors2006; 6: 925-953.

▷ Enhanced oligonucleotide–nanoparticle conjugate stability using thioctic acid modified oligonucleotides; J. A. Dougan, C. Karlsson, W. E. Smith and D. Graham; Nucleic Acids Res2007; 35: 3668-3675. doi:10.1093/nar/gkm237

▷ Design of biotin-functionalized luminescent quantum dots; K. Susumu, H. T. Uyeda, I. L. Medintz and H. Mattoussi; J Biomed Biotechnol 2007; 90651: 90651. doi:10.1155/2007/90651

▷ Toward Reliable Gold Nanoparticle Patterning On Self- Assembled DNA Nanoscaffold; J. Sharma, R. Chhabra, C. S. Andersen, K. V. Gothelf, H. Yan and Y. Liu; J Am Chem Soc 2008; 130: 7820-7821. doi:10.1021/ja802853r

▷ Simultaneous determination of α-lipoic acid and its reduced form by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection; S. Satoh, T. Toyo’oka, T. Fukushima and S. Inagaki; Journal of Chromatography B 2007; 854: 109-115. doi:10.1016/j.jchromb.2007.04.003

▷ Recent advances in separation and detection methods for thiol compounds in biological samples; T. Toyo’oka; Journal of Chromatography B 2009; 877: 3318-3330. doi:10.1016/j.jchromb.2009.03.034

▷ Oriented Immobilization of Antibodies with GST-Fused Multiple Fc-Specific B-Domains on a Gold Surface; T. H. Ha, S. O. Jung, J. M. Lee, K. Y. Lee, Y. Lee, J. S. Park and B. H. Chung; Anal Chem 2007; 79: 546-556. doi:10.1021/ ac061639+

▷ Polyethylene glycol-based bidentate ligands to enhance quantum dot and gold nanoparticle stability in biological media; B. C. Mei, K. Susumu, I. L. Medintz and H. Mattoussi; Nat. Protocols 2009; 4: 412-423. doi:10.1038/ nprot.2008.243

▷ Influence of anchoring ligands and particle size on the colloidal stability and in vivo biodistribution of polyethylene glycol-coated gold nanoparticles in tumor- xenografted mice; G. Zhang, Z. Yang, W. Lu, R. Zhang, Q. Huang, M. Tian, L. Li, D. Liang and C. Li; Biomaterials2009; 30: 1928-1936. doi:10.1016/j.biomaterials.2008.12.038

▷ Modular poly(ethylene glycol) ligands for biocompatible semiconductor and gold nanocrystals with extended pH and ionic stability; B. C. Mei, K. Susumu, I. L. Medintz, J.B. Delehanty, T. J. Mountziaris and H. Mattoussi; Journal of Materials Chemistry 2008; 18: 4949-4958. doi:10.1039/ b810488c

Lipoamine-dPEG™(x)-COOH

Lipoamide-dPEG™(x)-Biotin

PEG2166はアミンに対し反応活性を有し、2つのビオチンを持つPEG化試薬です。

Lipoamide-dPEG™(x)-mal

マレイミドは抗体やペプチド、オリゴヌクレオチド等の固定化に有用です。

Lipoamide-dPEG™(x)-OMe

Cleland試薬(DTT)

Cleland試薬はDTTとしても知られ、チオール化DNAの脱保護などに用いられます。チオール化DNAの末端のSは酸素存在下で酸化を受け、2量化する傾向にあります。

バイオセンサーの金属表面への固定化効率が落ちてしまうことからこの2量体を還元する必要があり、その際にDTTを用います。DTTはタンパク質のジスルフィド結合の還元や分子内及び分子間ジスルフィド結合の抑制にも使用されますが、溶媒が接近できないジスルフィド結合を還元することはできません。これを克服するため、ジスルフィド結合の還元はしばしば変性条件下で（高温や、6Mグアニジン塩酸塩、8M尿素または1％のドデシル硫酸ナトリウムのような強力な変性剤の存在下で）行われます。

逆に、ジスルフィド結合の溶媒への露出度をDTTの存在下でのそれらの還元速度により推定することができます。

Iris Biotech社のDTTは発がん性物質を中間体として生じない様に設計されたプロセスを使用しており、環境への影響を最小限に抑え、作業者の安全にも十分に配慮し製造されています。

参考文献

▷ Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH Groups*; W. W. Cleland; Biochemistry 1964; 3: 480-482. doi:10.1021/bi00892a002

▷ Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine; U. T. Rüegg and J. Rudinger; Methods in Enzymology C. H. W. Hirs and N. T. Serge 1977; 47: 111-116. doi:10.¹⁰¹⁶⁄₀₀₇₆-6879(77)47012-5

▷ From Production of Peptides in Milligram Amounts for Research to Multi-Tons Quantities for Drugs of the Future; T. Bruckdorfer, O. Marder and F. Albericio; Current Pharmaceutical Biotechnology 2004; 5: 29-43. doi:10.²¹⁷⁴⁄_{1389201043489620}

チオエステル-PEG-カルボン酸

これらの試薬は、タンパク質にPEGを挿入すると同時にアミノ末端をチオール末端に変換できる画期的な試薬です。チオールはマレイミド、ビニルスルホン、ハロアセトアミド等と反応性を持ち、特異的に反応させることが可能です。

in situ での実験手順例

ジクロロメタン（3Åのモレキュラーシーブ上で乾燥）を用いPEG-COOHの溶液を作成し、同じく乾燥条件下でEDCおよびNHSを加えます（縮合剤であるEDCは1.1-1.2等量加えます）。オーバーナイトにて反応を行い、溶媒を乾燥させたのち使用します。過剰のEDCおよび副生成物である尿素は少量のシリカゲルによっても除去することが可能です。縮合剤はDCC（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、DIC（ジイソプロピルカルボジイミド）も使用可能です。NHSだけでなく、DSC（炭酸ジ（N-スクシンイミジル））も活性化部位として用いることが可能です。

Ac-S-dPEG

チオール-PEG-COOH

両末端官能性のチオール-PEG-カルボン酸は金や銀などの金属表面への修飾に利用可能であり、修飾後は更なる化学変換も適用可能です。チオール-PEGは金属表面をはじめ、他のチオールやジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ハロアセトアミド等と反応性を持ち、水溶性の向上、凝集の抑制といった性質を付与しながら抗原性および免疫原性を示さないという特徴を持ちます。

これらの試薬は遊離のシステイン残基を含まないペプチドに対しチオール末端を付与するのに有用です。ジクロロメタンに非常に高い溶解性を示します。

保管方法

傘下による2量体化を防ぐため、必ず不活性気体下で保存するようにしてください。

Trt基およびMmt基の脱保護条件

トリチル（Trt）基は5%のTIS存在下、25-50%のTFAによって脱保護できます。

メトキシトリチル（Mmt）基はTIS存在下、<5%のTFAによって脱保護できます。

参考文献

▷ Bioconjugate Techniques; G. T. Hermanson; 2nd Edition; Elsevier 2008; ISBN 978-0-12-370501-3

PEG-SS-PEG

HS-FA(脂肪酸)-PEG

HS-PEG-COOH/NHS

OPSS-(d)PEG(x)-COOH/NHS

OPSS（ o-ピリジルジスルフィド）で保護されたチオール-PEGはカルボニル基によってターゲット分子のアミノ基と結合し、ジスルフィド結合を交換する形で別の還元チオール基を持つ分子を結合することが可能です。多くの生体分子はアミノ基を持ち、さらにチオール基を持っているもしくは持っていない場合でも何らかの手法によって組み込むことが可能です。マレイミドとチオールの結合によって形成される結合とは異なり、還元的条件で再び別のチオール基を持つ分子と交換できることが特徴です。

OPSS基のピリジン-2-チオンは交換反応によって系中で遊離するので、この分子が示す343nm付近の吸収を観測することで反応の進行状況をモニターすることが可能です。PEG-OPSSはチオールとジスフィド結合を形成でき、その後に別のチオール誘導体との交換やDTTなどによる還元など様々な応用が可能です。

参考文献

▷ Synthesis and Characterization of Insulin−Transferrin Conjugates; N. J. Kavimandan, E. Losi, J. J. Wilson, J. S. Brodbelt and N. A. Peppas; Bioconjug Chem 2006; 17: 1376-1384. doi:10.1021/bc050344k

▷ Bioconjugate Techniques; G. T. Hermanson; 2nd Edition; Elsevier 2008; 276-335; ISBN 978-0-12-370501-3

▷ Differential Conjugation of Tat Peptide to Superparamagnetic Nanoparticles and Its Effect on Cellular Uptake; M. Zhao, M. F. Kircher, L. Josephson and R. Weissleder; Bioconjug Chem 2002; 13: 840-844. doi:10.1021/bc0255236

▷ Antibody Linking to Atomic Force Microscope Tips via Disulfide Bond Formation; A. S. M. Kamruzzahan, A. Ebner, L. Wildling, F. Kienberger, C. K. Riener, C. D. Hahn, P. D. Pollheimer, P. Winklehner, M. Hölzl, B. Lackner, D. M. Schörkl, P. Hinterdorfer and H. J. Gruber; Bioconjug Chem 2006; 17: 1473-1481. doi:10.1021/bc060252a

▷ Quantitative Analysis of Derivatized Proteins Prepared with Pyridyl Disulfide-Containing Cross-Linkers by High-Performance Liquid Chromatography; D. H. Na, B. H. Woo and K. C. Lee; Bioconjug Chem 1999; 10: 306-310. doi:10.1021/bc980029g

▷ Synthesis and in Vitro Testing of J591 Antibody−Dendrimer Conjugates for Targeted Prostate Cancer Therapy; A. K. Patri, A. Myc, J. Beals, T. P. Thomas, N. H. Bander and J. R. Baker; Bioconjug Chem 2004; 15: 1174-1181. doi:10.1021/bc0499127

▷ Preparation of Thiol-Reactive Cy5 Derivatives from Commercial Cy5 Succinimidyl Ester†; H. J. Gruber, G. Kada, B. Pragl, C. Riener, C. D. Hahn, G. S. Harms, W. Ahrer, T. G. Dax, K. Hohenthanner and H.-G. Knaus; Bioconjug Chem 2000; 11: 161-166. doi:10.1021/bc990107f

▷ Michael-Type Addition as a Tool for Surface Functionalization; M. Heggli, N. Tirelli, A. Zisch and J. A. Hubbell; Bioconjug Chem 2003; 14: 967-973. doi:10.1021/bc0340621

▷ Covalent Protein−Oligonucleotide Conjugates for Efficient Delivery of Antisense Molecules; S. B. Rajur, C. M. Roth, J. R. Morgan and M. L.Yarmush; Bioconjug Chem 1997; 8: 935-940. doi:10.1021/bc970172u

▷ Basic Studies on Heterobifunctional Biotin−PEG Conjugates with a 3-(4-Pyridyldithio)propionyl Marker on the Second Terminus; K. Kaiser, M. Marek, T. Haselgrübler, H. Schindler and H. J. Gruber; Bioconjug Chem 1997; 8: 545-551. doi:10.1021/bc970086u

アミノ-PEG-チオール/ヒドラジド-PEG-チオール

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ヒドロキシ-PEG-チオール

チオールと反応性を持つマレイミド、ビニルスルホン、ハロアセトアミド等と反応し、水溶性の向上、凝集性の抑制を付与しながら抗原性および免疫原性を示さないという特徴を持ちます。

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メトキシ-PEG-チオール

メトキシPEG-チオールは修飾表面のチオールやジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ハロアセトアミド等と反応性を持ち、親水性を持たせることが可能です。これらの化合物はジクロロメタン、酢酸エチルなど極性有機溶媒一般に可溶ですが、メチルtert-ブチルエーテルやヘキサンには不溶です。金銀表面へPEGを挿入しながら末端をキャッピングしたい場合に最適の試薬と言えます。

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保管方法

酸化による2量体化を防ぐため、必ず不活性気体下で保存するようにしてください。ジスルフィド結合が形成されてしまった場合も、TCEPなどで還元可能です。

参考文献

▷ Bioconjugate Techniques; G. T. Hermanson; 2nd Edition; Elsevier 2008; ISBN 978-0-12-370501-3

ジチオール-PEG

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